EZH2结构与功能
表观遗传学是指不改变基因序列而导致的表型变化，包括DNA甲基化，组蛋白翻译后修饰，染色质重塑等。组蛋白翻译后修饰是指对组蛋白上的氨基酸进行多种共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化，泛素化和ADP核糖基化等。
组蛋白的乙酰化主要发生在赖氨酸残基上，赖氨酸侧链含有氨基，在生理条件下带正电荷，从而能够和含有磷酸基团的DNA紧密结合，被乙酰化后使得正电荷被中和，无法和DNA紧密结合使得染色质结构松散，促进基因的表达。组蛋白的乙酰化动态平衡由大量不同的组蛋白去乙酰转移酶（HDAC）和组蛋白乙酰化酶（HAT）调节。
(相关资料图)
Polycomb 群蛋白（PcG）是一组重要的表观遗传学调节因子，在细胞增殖，干细胞多能性和分化，基因表达异常恶性转化等中起重要作用。PcGs主要含有两种配合物，即多梳抑制复合物1（PRC1）和多梳抑制复合物2（PRC2）。PRC1，由PHCs、BMI1、CBX和RING1B亚基组成，催化组蛋白H2A的单泛素化（图1）1。
PRC2复合物包括EZH2，EED，SUZ12和RbAp46/48（图1）。EZH2是一种组蛋白乙酰化酶，它是PRC2复合物中的催化亚基，可以催化组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）三甲基化，诱导染色体凝集，进而抑制靶基因的转录1。
图1. PRC1和PRC2复合物
EZH2蛋白质结构主要包含五个结合结构域：EED相互作用域（EID），与PHF1和PCL（结构域I）的结合结构域，与SUZ12结合结构域，富含半胱氨酸的结构域（CXC）和SET结构域（图2）2。
图2. EZH2结构域
近年来，EZH2的病理调控机制见于许多疾病，目前已经开发了许多小分子EZH2抑制剂，包括一些被FDA批准上市的药物和一些已进入临床试验不同阶段的抑制剂。EZH2抑制剂目前主要适应症是非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkinlymphoma，NHL），而NHL根据细胞形态和病理类型分为弥散性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）和慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞瘤（CLL/SLL）等亚类。据2018年IARC统计，全球NHL新发病例近51万例，占据所有新发癌症病例的2.8%，发病率呈逐渐上升趋势。
单一从非霍奇金淋巴瘤市场看，到2023年，NHL市场预计将达到将近100亿美元。而小分子靶向药物研发成本相对较低，药物可及性强，一旦EZH2抑制剂在发病率较高的淋巴瘤（比如DLBCL、FL）上取得显著疗效和实体瘤上取得突破进展，将会强势竞争和渗透生物药和其他靶点抑制剂的市场份额。临床需求决定研发方向，EZH2抑制剂前景无限。
EZH2抑制剂
据不完全统计，目前该领域的在研药物四十余种，包括EZH2抑制剂和蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。其中有3款EZH2抑制剂已获批，分别是和黄与Epizyme共同开发的他泽司他（Tazemetostat，EPZ-6438），第一三共的伐美妥司他（valemetostat），以及强生开发的阿司咪唑，除此之外还有多款处于临床前和临床研究的抑制剂（表1）。
表1. EZH2抑制剂研发进展
部分典型化合物介绍
他泽司他（Tazemetostat，EPZ-6438）
2012年，Epizyme通过筛选175，000的高通量化合物库开发了第一个EZH2特异性抑制剂EPZ005687（化合物1，图3），它的结构通过酰胺键连接吡啶酮和吲唑，Ki 值为 24 nM，IC50值为54 nM3。
2013年，Epizyme优化了EPZ005687的结构。吡唑的五元环结构断开用苯胺替代，苯胺上的取代基经过SAR分析，发现通过取代乙基和THP获得化合物EPZ-6438（也称为Tazemetostat，化合物2，图3）显示出更强的效力，IC50值为4 nM。与EPZ005687相比，该化合物还显示出良好的药代动力学特性和口服生物利用度。EPZ-6438 对EZH1具有35倍的选择性以及与其他14种 HMT相比，超过> 4500倍的选择性。它对野生型EZH2和EZH2 Y641F、C、H、N、S 和 A677G 突变体表现出很高的体外效力。
后续人们基于EPZ-6438结构进行很多的优化和修饰。2015年，Epizyme报道了一种有效且选择性的EZH2抑制剂EPZ011989（化合物3，图3）。对于EPZ011989，EPZ-6438的四氢吡喃部分转化为4-氨基环己胺，吗啉甲基苯基被吗啉丙炔取代。化学结构的这些变化改善了药代动力学和药效学性质。
2015年，Zhang等报道了一种新的EZH2抑制剂SKLB1049（化合物4，图3），其核心结构为六氢异喹啉。SKLB1049对EZH2野生型、Y641F和A677G突变体非常有效，IC50值分别为7.3 nM、39 nM和5.9 nM。SKLB1049还显示出对EZH1的12倍选择性。
2016年，Song等人报告了一种有效的、高度选择性的、口服生物可利用的EZH2抑制剂ZLD1039（化合物5，图3）。以EPZ-6438结构为基础，用哌嗪吡啶尾取代甲基苯基吗啉，环合吡啶酮C4和C5形成缩合环己烯。
2018年，为了降低EPZ-6438的分子量和复杂性，江苏恒瑞公司的研究人员去除了EPZ-6438左侧的苯基侧链，合成了具有苯并呋喃结构的化合物EBI-2511（化合物6，图3）。它不仅表现出高酶和细胞抑制活性，IC50值分别为4.0 nM和6.0 nM，但也具有良好的药代动力学特性。
2020年，He等人对SKLB1049的哌嗪甲基苯基（溶剂暴露区）进行了结构优化，用于设计以及合成一系列（E）-2-二苯基乙烯衍生物。最初，在SKLB1049的两个苯环之间加入反式乙烯基。进一步探讨了苯侧链上不同取代基的SAR。初步优化发现化合物7（图3）具有有效的酶和细胞抑制活性，（EZH2 WT，IC50 = 22.0 nM；WSU-DLCL2细胞系，IC50 = 1.61 μM；SU-DHL-4细胞系，IC50 = 2.34 μM）4。
图3. 化合物1-7结构与活性
美国时间2020年1月23日，FDA宣布批准EZH2抑制剂Tazemetostat上市，批准的适应症为不适用于手术切除的转移性或晚期的上皮样肉瘤（ES）。除此之外，目前关于EZH2抑制剂Tazemetostat的临床研究有很多，针对不同的疾病或者与其它药物联合使用（表2）。
表2. Tazemetostat的临床在研状态
伐美妥司他（Valemetostat）
伐美妥司他（Valemetostat，图4）是一款新型、高选择性first-in-class的EZH1/2双重抑制剂，2021年获得美国FDA的罕见病用药资格认定，是在全球范围内第1个获得监管批准的治疗成人T细胞白血病/淋巴瘤 (Adult T-cell leukemia/lymphoma，ATL) 的EZH1和 EZH2双重抑制剂。表3显示Valemetostat目前临床研究试验。
图4. Valemetostat结构
表3. Valemetostat的临床在研状态
GSK-126
2012年，GSK通过高通量筛选和结构优化发现SAM竞争EZH2抑制剂GSK126（化合物8，图5A）5。GSK126含有与EPZ005687相同的吡啶酮基团，但其吲哚基团与EPZ005687的吲唑基团不同。GSK126对野生型和突变型EZH2均具有有效的抑制活性，Kiapp = 0.5-3 nM。GSK126对EZH2的选择性是其他20种人甲基转移酶的1000倍。其对EZH1的选择性超过150倍。
然而，GSK126缺乏口服生物利用度，因此在小鼠模型和随后的临床试验中需要静脉内（IV）给药。GSK126和PRC2共结晶结构（PDB：5WG6，图5B）显示GSK126中的吡啶酮结构也可以与W624形成两个的氢键。GSK126与F686的苯环有很强的π- π相互作用。其酰胺基团也可与Y111形成氢键。由吡啶基哌嗪组成的“尾部”区域向外指向EZH2和EED之间的溶剂暴露侧。
在SAR的指导下，分别合成化合物GSK926（化合物9，图5A），GSK343（化合物10，图5A）和GSK503（化合物11，图5A）。
同样，在2012年，诺华公司报告了一种有效且选择性的小型分子抑制剂EI1（化合物12，图5A）。El1与抑制剂GSK126具有相同的吡啶酮和吲哚核心结构。
2016年，Zhang等人开发了一种新型有效的EZH2抑制剂JQEZ5（化合物13，图5A）。其核心结构为吡啶酮和吡唑并吡啶。该化合物显示出优异的酶效力EZH2（IC50 = 11 nM）。在75 mg/kg下，JQEZ5显示出GSK-126在150 mg/kg时相同的抗肿瘤活性。
图5. 化合物8-13的结构与活性
CPI-1205和CPI-0209
2013年，Constellation Pharmaceuticals公司报告了一系列独特的含有四甲基哌啶基苯甲酰胺骨架的EZH2抑制剂，通过高通量筛选发现苗头化合物14（图6），其对WT EZH2具有51 μM的抑制活性，经过优化发现活性化合物17（图6）。
图6. 化合物14-17结构与活性
2014年，Constellation Pharmaceuticals公司报道了另一种EZH2抑制剂CPI-360（化合物18，图7）。它是一种酰胺连接吡啶酮和吲哚的化合物。它不仅具有出色的抑制活性（WT EZH2 IC50 = 0.5nM），也显示出显着的药代动力学特征。该公司基于此进行进一步的结构优化发现推进临床研究的化合物CPI-1205（图7）和CPI-0209。表3显示 CPI-1205和CPI-0209的临床在研进展。
图7. 化合物18-24结构与活性
表4. CPI-1205和CPI-0209的临床在研进展
PF-06821497
对于一些报道的 EZH2 抑制剂（如 GSK-126、EI1 和 CPI169），吡啶酮通常通过酰胺与双环芳族部分相连。然而，这种结构包含相对大量的平面芳环，通常会损害所获得化合物的溶解度。
EPZ-6438只有一个苯环该中心，它在临床上具有良好的应用前景。基于化合物25，辉瑞的研究团队尝试将苯环与酰胺连接起来，分别得到含有七元内酰胺结构的化合物26和含有六元内酰胺结构的化合物27（图8）。进一步优化得到化合物PF-06821497，目前进入临床I期研究，研究对复发/难治性 SCLC、去势抵抗性前列腺癌和滤泡性淋巴瘤治疗效果（NCT03460977）。
图8. 化合物25-29的结构
EZH2的PROTACs
除了EZH2抑制剂外，人们也开发了EZH2的蛋白靶向嵌合体（PROTACs），如图9所示，使用不同的连接链连接EZH2抑制剂和E3连接酶配体（如VHL配体、CRBN配体和金刚烷）。
图9 . EZH2的PROTACs 30-36的结构
小 结
作为一种重要的组蛋白甲基转移酶，EZH2介导的表观遗传机制紊乱在癌症的发生和发展中得到了深入研究，证实了EZH2是抗癌靶点。通过对EZH2蛋白结构的表征，揭示其SET结构域是其甲基转移酶的主要部分活性和SAM的结合位点。
随着药物化学和结构生物学的发展，越来越多的靶向EZH2的特异性抑制剂被发现。已经有三款抑制剂被批准上市，而且目前临床在研的抑制剂越来越多。Epizyme的EZH2抑制剂Tazemetostat在不到半年的时间内两次获得FDA批准，是表观遗传癌症药物的里程碑，表明EZH2抑制剂在癌症治疗领域的潜力。
虽然有证据表明单独使用EZH2抑制剂可能对某些肿瘤不是很有效，但替代策略的开发，如联合治疗，多靶点药物设计和开发，EZH2的靶向降解和蛋白质-蛋白质相互作用的破坏是高度期待的。
References
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